fichier rmd

202111_Rotenone/report_Rotenone.Rmd

+---
+title: Analyses 16s projet Rotenone Paula Perez Pardo
+description: |
+  Analyses 16S 
+author:
+  - name: Magali Monnoye
+    affiliation: INRAE - MICALIS
+date: "2021-11-16 (Last updated: `r Sys.Date()`)"
+bibliography: resources/biblio.bib # don't change
+csl: resources/biomed-central.csl # don't change
+output:
+  html_document:
+    lib_dir: site_libs
+    self_contained: false
+    number_sections: FALSE
+    code_folding: "hide"
+    toc: true
+    toc_depth: 5
+    toc_float: true
+    df_print: paged
+    css: ['css/styles.css', 'https://use.fontawesome.com/releases/v5.0.9/css/all.css']
+  pdf_document:
+    toc: yes
+  word_document:
+    toc: yes  
+always_allow_html: yes
+    
+---
+
+```{r setup, include=FALSE}
+knitr::opts_chunk$set(eval=FALSE, echo =FALSE,  #echo=TRUE pour afficher le code dans rapport
+                      cache = FALSE, message = FALSE, 
+                      warning = FALSE, cache.lazy = FALSE,
+                      fig.height = 5, fig.width = 10.5)
+```
+
+
+```{r datatable global options, echo=FALSE, eval=TRUE}
+options(DT.options = list(pageLength = 10,
+                          scrollX = TRUE,
+                          language = list(search = 'Filter:'),
+                          dom = 'lftipB',
+                          buttons = c('copy', 'csv', 'excel')))
+```
+
+
+- Espace de travail collaboratif [GitLab](https://forgemia.inra.fr/magali.monnoye/analyses_16s/202111_Rotenone)  
+
+- Adresse du dépot: git@forgemia.inra.fr:magali.monnoye/analyses_16s.git
+  
+- Repository sur la plateforme migale: <strong class="tool">ssh -X mmonnoye@migale.jouy.inrae.fr</strong> dans save/analyses_16S/202111_Rotenone/
+
+
+```{bash}
+#Pour faire des git clone / git add.....:
+#Via le terminal, se positionner dans le repertoire ou se trouve le depot donc ici:
+#~/work/Analyses_16S/202109_Utrech/
+#et faire les git souhaités...
+#Tout ce qu'on veut pusher
+git add FROGS*.tsv
+git add FROGS*.biom
+git add *.html
+git add *affiliation.tsv
+
+#Enusite faire les commits
+git commit -m "fichiers tsv"
+
+#Puis faire les push
+git push
+
+#Si gitlab fatal: pack exceeds maximum allowed size
+#Pour supprimer dernier commit:
+git reset HEAD~
+
+#Si gros conflits entre les git/Si impossible de faire de git pull/push (quelques pertes d'infos !!!!)
+git fetch --all
+git reset --hard origin/master
+
+#Pour supprimer les fichiers venndiagram
+rm -f VennDiagram*.log
+#Pour supprimer de force un dossier et tout ce qu'il contient
+rm -rf ... 
+
+# Si j'ai ce message d'erreur: "The following untracked working tree files would be overwritten by merge"
+# Faire ceci dan le terminal du rstudio:
+git add * 
+git stash
+git pull
+
+```
+
+# Rappel du contexte de l'étude
+
+Du microbiote d'enfants atteints de troubles du spectre autistique a été donné à des souris axéniques, afin de voir l'impact de ce transfert sur leur comportement mais aussi sur divers paramètres biochimiques
+
+Chez les donneurs, il y avait 4 groupes composés chacun de 4 enfants
+
+Un pool des 4 échantillons d'un même groupe a été fait pour le donner aux souris
+
+
+# Metabarcoding analysis
+
+## Import des séquences
+
+En premier, créer un nouveau dossier dans GitLab / Aller dans Rstudio / Faire un pull / Ouvrir Project
+
+Sur le terminal, je copie les dossiers nécéssaires pour l'export html
+
+```{bash}
+
+#sur le terminal, je me mets dans le repertoire cd 202110_BALBc/
+#puis je copie les fichiers ci dessous dans le nouveau dossier Rotenone:
+
+cp report_BALBc.Rmd ~/save/analyses_16s/202111_Rotenone/
+cp gitlab-ci.yml ~/save/analyses_16s/202111_Rotenone/
+
+cp -r resources/ ~/save/analyses_16s/202111_Rotenone/
+cp -r site_libs/ ~/save/analyses_16s/202111_Rotenone/
+cp -r css/ ~/save/analyses_16s/202111_Rotenone/
+
+```
+
+Puis j'importe les séquences
+
+```{bash}
+Import des séquences (fichiers FASTQ) sur migale : 
+Je crée un zip de mon fichier séquences (Selection des séquences / clic droit / 7-zip / Ajouter à l'archive / Format de l'archive .zip) et j'importe avec Upload
+
+Ou si trop de séquences, copier le dossier de séquences de l'ordi sur le serveur comme ceci: 
+Ouvrir le terminal et après C:\Users\magali> copier cette ligne:
+scp -r .\Documents\1-MANIPS\2021\2021-09_Lea\Sequences_BALBc\ mmonnoye@migale.jouy.inrae.fr:~/save/analyses_16s/202110_BALBc/
+
+```
+
+## Contrôle qualité
+
+Je me place dans le repertoire 202111_Rotenone/
+
+Je lance l'outil <strong class="tool">fastqc</strong> dédié à l'analyse de la qualité des basemodules issues d'un séquençage haut-débit
+
+J'utilise aussi <strong class="tool">multiqc</strong>
+
+
+```{bash}
+#Creation dossier FASTQC
+mkdir FASTQC
+mkdir LOGS
+
+#Je lance fastq
+for i in *.fastq.gz ; do echo "conda activate fastqc-0.11.8 && fastqc $i -o FASTQC && conda deactivate" >> fastqc.sh ; done
+qarray -cwd -V -N fastqc -o LOGS -e LOGS fastqc.sh
+
+#Je lance multiqc (-o pour specifier le dossier de destination)
+qsub -cwd -V -N multiqc -o LOGS -e LOGS -b y "conda activate multiqc-1.8 && multiqc FASTQC -o MULTIQC && conda deactivate"
+
+```
+
+Numéro du job **fastqc** sur le cluster de migale: 4045739.1-40:1
+
+Numéro du job **multiqc** sur le cluster de migale: 4045740
+
+Lien vers le [rapport multiqc](MULTIQC/multiqc_report.html)
+
+<div class="alert alert-success" role="alert">**Sequence Counts**
+
+L'échantillon 2.1 a un nombre de reads très faible.
+
+Cet échantillon devra être supprimé lors de l'analyse biostatistique.
+
+**Sequence Quality Histograms**
+
+Les scores de qualité moyens sont plutôt bons. 
+
+La courbe diminue un peu plus pour certains (zone orange) mais le chevauchement de R1 et R2 peut surmonter cela.
+
+Touts les reads ont une longueur de 250 bases. Il indique qu'aucun rognage n'a été effectué précédemment.
+     
+**Per Sequence Quality Scores**
+
+Une large majorité des reads à une qualité moyenne > 30 (99.9 % of confidence)
+
+**Per Base Sequence Content**
+
+L'outils est noté "failed" car la proportion des bases est biaisée en début de lecture ce qui est normal pour ce type de librairie.
+
+Cela ne nuiera pas aux analyses en aval.
+
+**Per Sequence GC Content**
+
+Not informative for amplicon data
+    
+**Per Base N Content**
+
+Il y a très peu de N bases présentes. 
+
+**Sequence Duplication Levels**
+
+Not informative for amplicon data
+
+**Overrepresented sequences**
+
+Not informative for amplicon data
+
+**Adapter Content** 
+
+Les adaptateurs Illumina sont présents à différents niveaux pour certains échantillons. C'est représentatif de petits fragments qui ont été séquencés. 
+
+Ces séquences seront supprimées plus tard avec FROGS.</div> 
+
+<div class="alert alert-success" role="alert">En résumé, à part pour l'échantillon 2.1, les séquences sont de très bonnes qualités</div>
+
+```{bash}
+#Creer archive 
+tar zcvf data.tar.gz *.fastq.gz
+#suppression des fichiers fastq car ils sont dans l'archive
+rm -f *.fastq.gz
+#suppression des fichiers zip dans FASTQC
+rm -f FASTQC/*.zip
+
+#Je copie l'archive data.tar.gz dans 202109_Utrech
+cp data.tar.gz ~/save/analyses_16s/202110_BALBc/
+cp -r MULTIQC ~/save/analyses_16s/202110_BALBc/
+
+#Suppression dossier Sequences_BALBc
+rm -rf Sequences_BALBc
+
+```
+
+## FROGS 
+
+### Nettoyage des reads
+
+Je vais d'abord utiliser l'outil <strong class="tool">preprocess</strong> 
+
+```{bash}
+#Je me déplace dans 202110_BALBc et je cree fichier FROGS
+mkdir FROGS
+mkdir LOGS
+
+qsub -cwd -V -N preprocess -o LOGS -e LOGS -pe thread 8 -R y -b y "conda activate frogs-3.2.2 && preprocess.py illumina --input-archive data.tar.gz --min-amplicon-size 200 --max-amplicon-size 490 --merge-software pear --five-prim-primer ACGGGAGGCAGCAG --three-prim-primer GGATTAGATACCCTGGTA --R1-size 250 --R2-size 250 --nb-cpus 8 --output-dereplicated FROGS/preprocess.fasta --output-count FROGS/preprocess.tsv --summary FROGS/preprocess.html --log-file FROGS/preprocess.log && conda deactivate"
+
+#Pour voir avancé d'un job
+qstat
+#Pour voir infos quand job terminé
+qacct -j 3982109
+
+```
+
+Numéro du job **preprocess** sur le cluster de migale: 4046130
+
+Les paramètres suivants ont été choisis : 
+
+|Parametre | Valeur | 
+|----------|--------|
+|--min-amplicon-size | 200 | 
+|--max-amplicon-size | 490 | 
+|--already-contiged |Séquences non contiguées |
+
+Lien vers le [rapport preprocess](FROGS/preprocess.html)
+
+- Le nombre de séquences par échantillon
+
+|Preprocess |Min |Max |
+|---------|--------|--------|
+|Avant|27598|49717|
+|Après|26228|47574|
+ 
+<div class="alert comment">Hormis pour l'échantillon 2.1, le pourcentrage de séquences gardées est de 92 à 96 %, ce qui est très bien et normal à ce stade</div>
+
+### Clustering
+
+Clustering à l'aide de <strong class="tool">swarm</strong> et d=1 
+
+```{bash}
+qsub -cwd -V -N clustering -o LOGS -e LOGS -pe thread 8 -R y -b y "conda activate frogs-3.2.2 && clustering.py --input-fasta FROGS/preprocess.fasta --input-count FROGS/preprocess.tsv --distance 1 --fastidious --nb-cpus 8 --log-file FROGS/clustering.log --output-biom FROGS/clustering.biom --output-fasta FROGS/clustering.fasta --output-compo FROGS/clustering_otu_compositions.tsv && conda deactivate"
+
+#Pour voir infos quand job en cours:
+qstat
+#Pour avoir infos quand job fini:
+qacct -j 4046530
+
+```
+
+Numéro du job **clustering** sur le cluster de migale: 4046530
+
+### Remove Chimera
+
+On détecte les chimeres avec <strong class="tool">vsearch</strong> 
+
+```{bash}
+qsub -cwd -V -N chimera -o LOGS -e LOGS -pe thread 8 -R y -b y "conda activate frogs-3.2.2 && remove_chimera.py --input-fasta FROGS/clustering.fasta --input-biom FROGS/clustering.biom --non-chimera FROGS/remove_chimera.fasta --nb-cpus 8 --log-file FROGS/remove_chimera.log --out-abundance FROGS/remove_chimera.biom --summary FROGS/remove_chimera.html && conda deactivate"
+
+qacct -j 4046537
+
+```
+
+Numéro du job **chimera** sur le cluster de migale: 4046537
+
+Lien vers le [rapport remove_chimera](FROGS/remove_chimera.html)
+
+- Voici le nombre de séquences gardées et retirées  
+
+|Remove Chimera|Kept|Removed
+|---------|--------|--------|
+|Clusters|48711|55712|
+|Abundance|536743|158730|
+
+<div class="alert comment">Le nombre de clusters gardés par échantillon varie lui de 2325 (3.6) à 3973(4.3), ceci est normal à ce stade car on retire les séquences chimériques</div>
+
+### Filtres sur l'abondance et la prevalence
+
+On retire les OTUs les moins abondants, limite 0,005%
+
+On retire egalement les séquences phiX
+
+J'utlise l'outil <strong class="tool">otu_filters</strong>
+
+```{bash}
+qsub -cwd -V -N filters -o LOGS -e LOGS -pe thread 8 -R y -b y "conda activate frogs-3.2.2 && otu_filters.py --input-fasta FROGS/remove_chimera.fasta --input-biom FROGS/remove_chimera.biom --output-fasta FROGS/filters.fasta --nb-cpus 8 --log-file FROGS/filters.log --output-biom FROGS/filters.biom --summary FROGS/filters.html --excluded FROGS/filters_excluded.tsv --contaminant /db/frogs_databanks/contaminants/phi.fa --min-sample-presence 1 --min-abundance 0.00005 && conda deactivate"
+
+qacct -j 4046541
+```
+
+Numéro du job **filters** sur le cluster de migale: 4046541
+
+Lien vers le [rapport filters](FROGS/filters.html)
+
+- Voici le nombre d'OTUs et de séquences gardés et retirés  
+
+|Filters|Kept|Removed |
+|---------|--------|--------|
+|OTUs|620|48091|
+|Abundance|473260|63483|
+
+### Affiliation 
+
+Maintenant, je vais affillier les séquences sur la database <strong class="tool">silva</strong> v138
+
+Création fichier **affiliation.biom** pour import **affiliationExplorer**
+
+```{bash}
+qsub -cwd -V -N affiliation -o LOGS -e LOGS -pe thread 8 -R y -b y "conda activate frogs-3.2.2 && affiliation_OTU.py --input-fasta FROGS/filters.fasta --input-biom FROGS/filters.biom --nb-cpus 8 --log-file FROGS/affiliation.log --output-biom FROGS/affiliation.biom --summary FROGS/affiliation.html --reference /db/frogs_databanks/assignation/silva_138_16S/silva_138_16S.fasta && conda deactivate"
+
+Job 4046545
+qstat
+
+#Rapport de l'affiliation des OTUs
+qsub -cwd -V -N affiliations_stats -o LOGS -e LOGS -b y "conda activate frogs-3.2.2 && affiliations_stat.py --input-biom FROGS/affiliation.biom --output-file FROGS/affiliations_stats.html --log-file FROGS/affiliations_stats.log --multiple-tag blast_affiliations --tax-consensus-tag blast_taxonomy --identity-tag perc_identity --coverage-tag perc_query_coverage  && conda deactivate"
+
+Job 4046552
+
+```
+
+Numéro du job **affiliation** sur le cluster de migale: 4046545
+
+Lien vers le [rapport affiliation_OTU](FROGS/affiliation.html)
+
+Numéro du job **affiliation_stats** sur le cluster de migale: 4046552
+
+Lien vers le [rapport affiliations_stats](FROGS/affiliations_stats.html)
+
+<div class="alert comment">La quasi totalité des échantillons ont un pourcentage d'identité >95% et un pourcentage de couverture de >99%</div>
+
+### Multi affiliation
+
+Création fichiers **multi_aff.tsv** pour import **affiliationExplorer** et **affiliation.tsv** qui sera la table d'abondance 
+
+```{bash}
+qsub -cwd -V -N biom_to_tsv -o LOGS -e LOGS -b y "conda activate frogs-3.2.2 && biom_to_tsv.py --input-biom FROGS/affiliation.biom --input-fasta FROGS/filters.fasta --output-tsv FROGS/affiliation.tsv --output-multi-affi FROGS/multi_aff.tsv --log-file FROGS/biom_to_tsv.log  && conda deactivate"
+
+Job 4046554
+
+```
+
+Numéro du job **biom_to_tsv** sur le cluster de migale: 4046554
+
+Je vais "rectifier" toutes les multis affiliations sur **affiliationExplorer** en important **multi_aff.tsv** et **affiliation.biom**
+
+* Lien pour accéder au module: [affiliationExplorer](https://shiny.migale.inrae.fr/app/affiliationexplorer)
+
+Je refais un  <strong class="tool">affiliations_stats</strong> sur le biom nettoyé des multis affiliations
+
+```{bash}
+#Il faut importer le fichiers "cleaned_biom-2021-06-17.biom" généré par affiliationExplorer
+
+#Affiliation stat pour comparer avant et après correction avec affiliationExplorer
+qsub -cwd -V -N affiliations_stats_cleaned -o LOGS -e LOGS -b y "conda activate frogs-3.2.2 && affiliations_stat.py --input-biom cleaned_biom-2021-10-19.biom --output-file FROGS/affiliations_stats_cleaned.html --log-file FROGS/affiliations_stats_cleaned.log --multiple-tag blast_affiliations --tax-consensus-tag blast_taxonomy --identity-tag perc_identity --coverage-tag perc_query_coverage  && conda deactivate"
+
+Job 3983975
+
+```
+
+Lien vers le [rapport affiliations_stats_cleaned](FROGS/affiliations_stats_cleaned.html)
+
+<div class="alert comment">Suite aux différents outils FROGS utilisés pour le nettoyage des séquences, l'échantillon 113pq2 n'a plus que 1250 reads alors que tous les autres échantillons ont un nombre de reads > 15000, cet échantillon devra être supprimé lors de la rarefaction pour éviter de rarefier sur trop peu de séquences</div>  
+
+### Tree
+
+Je crée l'arbre phylogénique avec <strong class="tool">tree</strong>
+
+```{bash}
+
+#Pour avoir aide sur outils tree.py
+conda activate frogs-3.2.2 && tree.py --help
+
+#Creation arbre phylogenique
+qsub -cwd -V -N tree -o LOGS -e LOGS -b y "conda activate frogs-3.2.2 && tree.py --input-sequences  FROGS/filters.fasta --biom-file cleaned_biom-2021-10-19.biom --out-tree FROGS/tree.nhx --html FROGS/tree.html --log-file FROGS/tree.log  && conda deactivate"
+
+Job 3983983
+```
+
+Lien vers l'arbre [Tree](FROGS/tree.html)
+
+# Metagenomic phyloseq analysis 
+
+## Import packages et données
+
+```{r load-packages, eval=TRUE, cache = FALSE}
+
+library(kableExtra)
+library(DT)
+library(tidyverse)
+library(phyloseq)
+library(phyloseq.extended)
+library(data.table)
+library(plotly)
+library(cowplot)
+library(vegan)
+```
+
+J'importe les données 
+
+```{r import-data, eval=TRUE}
+#si impossible de trouver la fonction "read.tree"
+library(ape) 
+
+ if(file.exists("frogs.data.rds")){
+   frogs.data <- readRDS("frogs.data.rds")
+ }else{
+  frogsBiom <- "cleaned_biom-2021-10-19.biom"
+  frogs.data.biom <- import_frogs(frogsBiom, taxMethod = "blast")
+  
+  metadata<-read.table("metadatasBALBc.txt",row.names=1, header=T)
+  
+  sample_data(frogs.data.biom)<-metadata
+  sample_names(frogs.data.biom) <- get_variable(frogs.data.biom, "Name")
+  frogs.data<-frogs.data.biom
+  
+  treefile<- read.tree("tree.nhx") 
+  phy_tree(frogs.data) <- treefile
+  
+  tax_table(frogs.data) <- gsub("\"", "", tax_table(frogs.data))
+  tax_table(frogs.data) <- gsub("unknown.*", "Unknown", tax_table(frogs.data))
+  
+  #sauvegarde de l'objet forgs.data et .rds
+  saveRDS(frogs.data, file = "frogs.data.rds")
+  
+}
+
+```
+
+Je dispose de l'object phyloseq suivant:
+
+```{r data-preview, eval=TRUE, echo=TRUE}
+frogs.data
+
+```
+
+qui contient les métadonnées suivantes:
+
+```{r metadata, eval=TRUE, echo=TRUE}
+sample_variables(frogs.data)
+```
+Composition des groupes:
+
+* AG : enfants atteints de TSA et ayant aussi des troubles gastro-intestinaux
+
+* S-AG: leurs frères et sœurs comme contrôles
+
+* A: Enfants atteints de TSA sans troubles gastro-intestinaux
+
+* S-A: leurs frères et sœurs comme contrôles
+
+Pour vérifier l'implantation du microbiote et voir les éventuelles différences entre les groupes, les fèces ont été prélévées à 3 et 6 semaines après le transfert et une partie du contenu cæcal a été gardée pour faire l'analyse 16S.
+
+* Nombre d'échantillons par groupe:
+
+```{r variable-1, eval = TRUE, echo=TRUE}
+table(get_variable(frogs.data, "Group"))
+```
+
+* Nombre d'échantillons par statut: 
+
+```{r variable-2, eval = TRUE, echo=TRUE}
+table(get_variable(frogs.data, "Statut"))
+```
+
+* Nombre d'échantillons par cohorte:
+
+```{r variable-3, eval = TRUE, echo=TRUE}
+table(get_variable(frogs.data, "Cohorte"))
+```
+
+## Sélection des données
+
+```{r sample selection 1,fig.width=10,fig.height=4, eval=TRUE, echo = TRUE}
+
+frogs.data <- subset_samples(frogs.data, Cohorte == "Cohorte_1")
+frogs.data
+```
+
+## Visualisation de l'abondance par échantillon {.tabset}
+
+### Abondances brutes
+
+```{r 01-plot abondances, eval = TRUE}
+p<-plot_bar(frogs.data)
+plot(p)
+```
+
+### Abondances niveau Phylum 
+
+```{r 02-plot abondances phylum, eval = TRUE}
+p <- plot_bar(frogs.data, fill = "Phylum")
+plot(p)
+```
+
+
+## Composition des communautés 
+
+### Représentation des communautés au niveau Phylum {.tabset}
+
+* Nombre d'OTUs par Phylum:
+
+```{r count-phylum, eval = TRUE}
+#Get count of phyla
+table<-table(phyloseq::tax_table(frogs.data)[, "Phylum"])
+table
+```
+
+#### Tableaux relatives abondances Phylum 
+
+* Relatives Abondances par échantillons:
+
+```{r relative abundance-phylum, eval = TRUE}
+
+#Convert to relative abundance
+data_rel_abund = phyloseq::transform_sample_counts(frogs.data, function(x) 100 * x/sum(x)) 
+
+#Agglomerate to phylum-level and rename
+data_phylum <- phyloseq::tax_glom(data_rel_abund, "Phylum")
+
+phyloseq::taxa_names(data_phylum) <- phyloseq::tax_table(data_phylum)[, "Phylum"]
+rel_abun<-phyloseq::otu_table(data_phylum)
+
+rel_abun %>%
+ DT::datatable(extensions = 'Buttons', 
+                                        options = list(dom = 'Bfrtip', 
+                                                       pageLength = 20,
+                                                       buttons = list('copy', 'csv', 'excel'))) 
+
+```
+
+* Relatives abondances par groupes: 
+
+```{r 9-relative abundance-phylum, eval = TRUE}
+#Convert to relative abundance
+data_rel_abund = phyloseq::transform_sample_counts(frogs.data, function(x) 100 * x/sum(x))
+
+#Agglomerate to phylum-level and rename
+data_phylum <- phyloseq::tax_glom(data_rel_abund, "Phylum")
+
+ps1 <- merge_samples(data_phylum, "Group")
+data_phylum_2 <- transform_sample_counts(ps1, function(x) 100 * x/sum(x))
+
+phyloseq::taxa_names(data_phylum_2) <- phyloseq::tax_table(data_phylum_2)[, "Phylum"]
+rel_abun2<-phyloseq::otu_table(data_phylum_2)
+rel_abun2 %>%
+ DT::datatable(extensions = 'Buttons', 
+                                        options = list(dom = 'Bfrtip', 
+                                                       pageLength = 20,
+                                                       buttons = list('copy', 'csv', 'excel')))
+```
+
+
+#### Plot composition Phylum
+
+```{r 05-composition-phylum, eval = TRUE, fig.height=15, fig.width=15}
+correct.order <- c("S-A_F3w","A_F3w","S-AG_F3w","AG_F3w","S-A_F6w","A_F6w","S-AG_F6w","AG_F6w", "S-A_Caec", "A_Caec", "S-AG_Caec", "AG_Caec" )
+sample_data(frogs.data)$Group <- factor(sample_data(frogs.data)$Group,
+levels = correct.order)
+
+p <- plot_composition(frogs.data, "Kingdom", "Bacteria", "Phylum",numberOfTaxa = 6, fill = "Phylum")
+p<- p + facet_wrap(~Group, scales = "free_x", nrow = 3) +
+    theme(strip.text.x = element_text(size = 14, color = "black"))  +
+      scale_y_continuous(label = scales::percent)
+
+plot(p)
+```
+
+
+```{r 06-composition-phylum-merged, eval = TRUE, fig.height=10, fig.width=10}
+frogs.data.merged<-merge_samples(frogs.data,group="Group")
+sample_data(frogs.data.merged)$Group <- sample_names(frogs.data.merged)
+
+correct.order <- c("S-A_F3w","A_F3w","S-AG_F3w","AG_F3w","S-A_F6w","A_F6w","S-AG_F6w","AG_F6w", "S-A_Caec", "A_Caec", "S-AG_Caec", "AG_Caec")
+sample_data(frogs.data.merged)$Group <- factor(sample_data(frogs.data.merged)$Group,
+levels = correct.order)
+
+p <- plot_composition(frogs.data.merged, "Kingdom", "Bacteria", "Phylum",numberOfTaxa = 6, fill = "Phylum")
+p <- p + facet_wrap(~Group, scales = "free_x", nrow = 3)
+p <- p + ggtitle("Phylum Composition (12 top Phylum)")+
+      scale_y_continuous(label = scales::percent) +  theme(axis.text.x = element_blank())
+
+plot(p)